آنالیز داده های بیانی ریل تایم PCR
🧠 مقدمه: چرا Ct مهم است؟
در دستگاه ریلتایم PCR، وقتی DNA هدف در هر چرخه تکثیر میشود، شدت نور فلورسانت افزایش مییابد.
دستگاه همیشه دنبال لحظهای است که سیگنال فلورسانت از سطح زمینه جدا شود → این لحظه، Cycle threshold (Ct) نام دارد.
🔹 Ct پایینتر = مقدار اولیهٔ RNA یا DNA هدف بیشتر بودهاست
🔹 Ct بالاتر = مقدار اولیه کمتر بوده
یعنی Ct دقیقاً مثل «زمان رسیدن به نقطه جوش» است: هرچه زودتر برسیم، غلظت اولیه بیشتر بوده.
⚙️ هدف از آنالیز ΔCt
در آزمایش بیان ژن، هیچوقت مقدار مطلق DNA یا RNA مهم نیست؛ بلکه میخواهیم بدانیم:
آیا ژن هدف در نمونه مورد آزمایش نسبت به نمونهٔ شاهد، بیشتر یا کمتر بیان شده است؟
اما چون مقدار RNA استخراجشده یا حجم cDNA ممکن است در بین نمونهها متفاوت باشد، باید به چیزی پایدار و قابل مقایسه نسبت دهیم → ژن مرجع (Housekeeping gene).
م🧩 مرحله ۱: جمعآوری Ctها
فرض کنیم دو ژن داریم:
| ژن | نمونه کنترل (Ct) | نمونه آزمایش (Ct) |
|---|---|---|
| ژن هدف (Target) | 25 | 20 |
| ژن مرجع (Reference) | 18 | 17 |
ژن مرجع معمولاً چیزی مثل GAPDH، ACTB (بتا اکتین) یا 18S rRNA است که بیانش در همه سلولها ثابت میماند.مثل معیاری برای نرمالسازی.
🧮 مرحله ۲: محاسبه ΔCt
برای هر نمونه، ابتدا مقدار Ct ژن هدف را از Ct ژن مرجع کم میکنیم تا اثر غلظت اولیه و تفاوتهای کلی حذف شود.
فرمول:
ΔCt=CtTarget−CtReference ΔCt = Ct_{\text{Target}} – Ct_{\text{Reference}} ΔCt=CtTarget−CtReference
| نمونه | Ct_target | Ct_reference | ΔCt |
|---|---|---|---|
| کنترل | 25 | 18 | 7 |
| آزمایش | 20 | 17 | 3 |
یعنی در نمونه آزمایش، فاصله بین ژن هدف و مرجع کمتر شده → بیان ژن هدف نسبتاً زیادتر است.
🔢 مرحله ۳: محاسبه ΔΔCt
هدف این مرحله مقایسهٔ بین دو ΔCt است — معمولاً بین آزمایش و کنترل.
فرمول:
ΔΔCt=ΔCtSample−ΔCtControl
طبق جدول بالا:
ΔΔCt=3−7=−4
منفی شدن ΔΔCt یعنی بیان ژن هدف افزایش یافته در نمونه آزمایش نسبت به کنترل.
💡 مرحله ۴: محاسبهٔ نسبت بیان ژن (Fold Change)
چون در PCR هر چرخه تئوریکاً مقدار DNA دو برابر میشود، بهصورت نمایی با پایهٔ ۲ محاسبه میکنیم:
Fold Change=2^−ΔΔCt
در مثال:
2^−(−4)=2^4=16
🧾 نتیجه:
ژن هدف در نمونه آزمایش، ۱۶ برابر بیشتر از کنترل بیان شده است.
📊 تفسیر عددها
2^ ΔΔCt | معنی زیستی |
|---|---|
| > 1 | افزایش بیان |
| = 1 | تغییر ندارد |
| < 1 | کاهش بیان |
مثلاً:
- ⚖️ پیشفرضها و نکات فنی مهم
✅ کارایی PCR (Efficiency)
روش ΔΔCt فرض میکند کارایی PCR هر دو ژن تقریباً برابر و نزدیک به ۱۰۰٪ است (یعنی هر چرخه دو برابر میشود).
اگر کاراییها متفاوت باشند، باید از روش Pfaffl استفاده شود که دیگر از توان ۲ صرفنظر کرده و کارایی واقعی را وارد فرمول میکند.
✅ انتخاب ژن مرجع
باید ثابتترین ژن در بین تمام شرایط آزمایش باشد. برای سلولهای انسانی معمولاً:
GAPDH
β‑Actin
18S rRNA
اما باید پیشآزمایش پایداری انجام گیرد تا مطمئن شویم تحت شرایط آزمایش دچار تغییر نمیشود.
✅ تکرار و انحراف معیار
باید برای هر نمونه حداقل سه تکرار فنی (Technical replicates) انجام شود تا میانگین Ctها و خطای استاندارد محاسبه شود.
در گزارش علمی معمولاً مقدار بیان بهصورت Mean±SD یا در نمودار لگاریتمی (log₂ scale) نمایش داده میشود.
دیدگاهتان را بنویسید