🧬 بخش اول: یادآوری مفهوم PCR معمولی

🔹 PCR چیست؟

PCR (Polymerase Chain Reaction) یعنی “واکنش زنجیره‌ای پلیمراز”.

کاری که انجام می‌دهد:

از یک قطعه کوچک DNA، میلیون‌ها نسخه مشابه آن را در چند ساعت می‌سازد.

این مثل یک سیستم فتوکپی زیستی است که آنچه DNA دارد را بارها تکثیر می‌کند.

🔹 اجزای اصلی واکنش PCR

1. DNA الگو (Template): همان چیزی که می‌خواهیم از آن نسخه بگیریم.
2. پرایمرها (Primers): قطعات کوتاه DNA که نقطه شروع کار آنزیم را مشخص می‌کنند.
3. آنزیم Taq Polymerase: مولکولی که عمل کپی کردن DNA را انجام می‌دهد.
4. نوکلئوتیدها (dNTPs): مصالح ساختمانی DNA جدید.
5. بافر و MgCl₂: محیط مناسب برای عملکرد آنزیم.

🔹 چرخه‌های دما (Thermocycling)

PCR در دستگاهی انجام می‌شود که دمایش به‌صورت متناوب تغییر می‌کند:

1. جداسازی رشته‌ها (Denaturation) = 95°C
2. چسبیدن پرایمرها (Annealing) ≈ 55–65°C
3. کپی‌برداری (Extension) = 72°C

این سه مرحله بارها تکرار می‌شوند (معمولاً 30–40 بار)، و هر بار مقدار DNA دو برابر می‌شود.

⚡ بخش دوم: مشکل PCR معمولی

PCR معمولی فقط در پایان کار محصول را نشان می‌دهد — مثلاً روی ژل آگاروز.

یعنی نمی‌فهمیم در طول واکنش چه مقدار DNA ساخته می‌شود و در چه زمانی واکنش از زمینه جدا می‌شود.

برای مثال، اگر دو نمونه DNA مختلف داشته باشیم، بعد از PCR نمی‌توانیم دقیق بگوییم کدام یکی مقدار اولیه بیشتری داشته‌اند.

💡 بخش سوم: ایده Real‑Time PCR

ایده اصلی:

در PCR زمان واقعی، مقدار DNA تولیدشده در هر لحظه (هر چرخه) به‌صورت فلورسانس نوری اندازه‌گیری می‌شود.

یعنی دستگاه در حین تکثیر، شدت نور فلورسانت را پایش می‌کند — این همان چیزی است که به روش نام REAL‑TIME داده است.

🔹 چطور مقدار را در لحظه اندازه می‌گیریم؟

از رنگ‌هایی استفاده می‌شود که وقتی به DNA دو رشته‌ای متصل شوند نور می‌تابانند.

دو نوع رایج رنگ یا سیستم وجود دارد:

1. SYBR Green
   • به هر DNA دو رشته‌ای وصل می‌شود.
   • هرچه DNA بیشتر شود → نور فلورسانت بیشتر.
   • ساده، اقتصادی، اما گاهی اختصاصی‌اش کمتر است.
2. TaqMan Probe
   • یک قطعه DNA فلورسنت اختصاصی است که فقط به توالی هدف متصل می‌شود.
   • دقت بالا، ولی هزینه بیشتر.

📈 بخش چهارم: منحنی تکثیر (Amplification curve)

نتیجه دستگاه به شکل نمودار است:

• محور X: شماره چرخه‌های PCR
• محور Y: مقدار فلورسانس (یعنی چقدر DNA دو رشته‌ای داریم)

در ابتدا مقدار نور کم است، چون هنوز DNA کمی وجود دارد.

بعد از چند چرخه، رشد نمایی آغاز می‌شود و منحنی بالا می‌رود.

جایی که منحنی از سطح زمینه جدا می‌شود را Cycle threshold (Ct) می‌نامند.

درک ساده Ct:

هرچه Ct کوچک‌تر باشد، یعنی از ابتدا DNA بیشتری وجود داشته است.

مثلاً:

• نمونه A با Ct = 20
• نمونه B با Ct = 28

نمونه A هفت چرخه زودتر به حد قابل اندازه‌گیری رسیده → بیان ژنش بیشتر بوده.

📊 بخش پنجم: کاربردها

1️⃣ مطالعه بیان ژن‌ها (Gene Expression)

بررسی اینکه یک ژن در سلول در چه اندازه فعال است.

مثلاً در پاسخ به دارو یا استرس، میزان RNA آن ژن چقدر تغییر می‌کند.

در اینجا چون RNA داریم، مرحله‌ی اول تبدیل RNA به DNA است (RT مرحله):

RT‑qPCR = Reverse Transcription + Real‑Time PCR

یعنی ابتدا:

• RNA → cDNA (با آنزیم Reverse Transcriptase)

سپس همان روش qPCR روی cDNA انجام می‌شود.

2️⃣ تشخیص بیماری‌ها

مثلاً وجود ویروس کرونا، HIV یا انواع باکتری‌ها را با qPCR بررسی می‌کنند.

چون اگر در نمونه حتی مقدار کمی RNA یا DNA ویروس باشد، دستگاه qPCR آن را تشخیص می‌دهد (حساسیت بالایی دارد).

⚖️ بخش ششم: تفسیر نتیجه

برای اندازه‌گیری میزان بیان ژن‌ها بین نمونه‌ها از روش ΔΔCt استفاده می‌شود:

1. ابتدا Ct ژن هدف را از Ct ژن مرجع کم می‌کنیم → ΔCt (ژن مرجع مثل GAPDH یا ACTB که همیشه بیان پایدار دارد)
2. بعد ΔCt نمونه را با ΔCt کنترل مقایسه می‌کنیم → ΔΔCt
3. در نهایت: بیاننسبی=2−ΔΔCt بیان نسبی = 2^{−ΔΔCt} بیاننسبی=2−ΔΔCt

این فرمول درک ساده‌ای دارد:

اگر عدد حاصل بزرگ‌تر از 1 باشد یعنی ژن هدف در نمونه بیشتر بیان شده،

اگر کمتر از 1 باشد یعنی بیان کاهش یافته.

فرض کنید می‌خواهید بدانید ژن “X” در سلول‌های تحت استرس بیشتر کار می‌کند یا نه.

• RNA هر دو نمونه را می‌گیرید.
• آن‌ها را تبدیل به cDNA می‌کنید.
• سپس با qPCR مقدار ژن X را اندازه می‌گیرید.
• اگر Ct نمونه استرس‌یافته 22 باشد و نمونه کنترل 28، یعنی سلول‌های تحت استرس بیان ژن X را افزایش داده‌اند.