روش حرفه ای آنالیز بیان ژنی با ریل تایم PCR

🔬 مقدمه: چرا به روش Pfaffl نیاز داریم؟

روش معمولی ΔΔCt فرض می‌کند که هر چرخه PCR باعث دو برابر شدن (۱۰۰٪ کارایی) محصول می‌شود.

اما در واقعیت، کارایی واکنش می‌تواند مثلاً ۹۰٪ یا ۸۵٪ باشد، یعنی هر چرخه به‌جای دو برابر شدن، کمی کمتر تولید می‌کند.

اگر ژن هدف و ژن مرجع کارایی‌های متفاوتی داشته باشند، نتیجه‌ی روش ΔΔCt دیگر دقیق نیست.

در چنین مواردی، از روش حرفه‌ای‌تر Pfaffl (Pfaffl Method, 2001) استفاده می‌شود تا این اختلاف اصلاح گردد.

Pfaffl گفت:

مقدار بیان نسبی باید متناسب با کارایی PCR در هر چرخه، نه فقط با عدد Ct، باشد.

بنابراین فرمول به شکل زیر تغییر می‌کند:

ولی چون معمولاً اختلاف نسبت به کنترل هم داریم، شکل نهایی فرمول در مقایسه با نمونه کنترل می‌شود:

📖 تعریف پارامترها:

برای به‌دست آوردن کارایی هر جفت پرایمر باید آزمایش منحنی استاندارد (Standard curve) انجام دهی:

1️⃣ یک سری رقت‌های متوالی از نمونه DNA یا cDNA بساز (مثلاً 1، 1/10، 1/100، 1/1000).

2️⃣ برای هر رقت، qPCR بگیر و Ct را یادداشت کن.

3️⃣ نمودار Ct\text{Ct}Ct در مقابل log⁡(غلظت)\log(\text{غلظت})log(غلظت) را بکش.

4️⃣ شیب خط را از رابطه‌ی خطی به‌دست آور:

E=10^(−1/slope) −1

اگر E = 1 (یعنی 100٪ کارایی)، همانند روش ΔΔCt ساده است.

اما اگر، مثلاً شیب خط = −3.58، آنگاه:

E=10^(−1/−3.58)−1=0.90

یعنی کارایی 90٪.